Reverso Transcriptase R3001 2000U R3002 10000U do PCR do Rt do ouro

Reverso Transcriptase R3001 do ouro (2,000U) R3002 (10,000U)

Reverso Transcriptase do ouro

Para o uso da pesquisa somente

Componentes

Armazenamento

Este reagente deve ser mantido em -30~15°C.

Descrição

O reverso Transcriptase do ouro é um transcriptase reverso novo obtido in vitro pela evolução molecular baseada no reverso Transcriptase de M-MLV (RNase h). A primeira costa do cDNA pode ser sintetizada no reverso Transcriptase do ouro 37~55°C. tem promover a sensibilidade significativamente melhorada, a especificidade, a estabilidade térmica e a meia-vida, que é muito apropriada para a transcrição reversa de moldes do RNA com estrutura secundária complexa. O reverso Transcriptase do ouro tem uma capacidade mais forte da polimerização e da extensão, que possa ser usada para a síntese do cDNA longo e a construção da elevada percentagem da biblioteca completo do cDNA.

Definição da unidade

Poli (rA)·Oligo (descolamento) foi usado como o molde/primeira demão. Em 37°C para o minuto 10, a quantidade de enzima exigida para adicionar 1 dTTP do nmol como uma substância insolúvel nos ácidos foi definida como 1 unidade de atividade (U).

Controle da qualidade

Detecção do resíduo de Exonuclease: A carcaça único-encalhada pmol do ADN 200 U deste produto e 50 foi incubada em 37°C para 16 h, e a faixa da eletroforese do ADN não mudou após a eletroforese da PÁGINA da desnaturação.

Detecção de resíduo do endonuclease: 200 U deste produto e de 0,3 μg de ADN pBR322 foram incubados em 37°C para 4 h, e as faixas da eletroforese dos plasmídeo não foram mudadas pela eletroforese do gel do agarose.

Detecção do resíduo do RNase: o produto de 200 U e 1 μg do RNA de 293 células foram incubados em 37°C para o minuto 30, e a faixa da eletroforese do RNA era inalterada pela eletroforese do gel do agarose.

Detecção do resíduo do ADN de E.coli: o resíduo ácido nucleico em 60 U foi detectado pelo qPCR gDNA-específico de Escherichia Coli TaqMan, e o resíduo do genoma de Escherichia Coli era menos de 10 cópias.

Detecção funcional 1: a enzima de 200 U foi adicionada ao sistema reverso da transcrição, 1 RNA total das pilhas HeLa do μg foi usado como o molde, (descolamento) ₂₃ oligo como a primeira demão, e a reação foi conduzida em 50°C para o produto do cDNA 45 min.1/10 foi tomada para a amplificação do PCR do gene de VIN. A eletroforese do gel do Agarose com mancha do EB mostrou uma única faixa de 4,6 kb.

Detecção funcional 2: a enzima de 200 U foi adicionada ao sistema reverso da transcrição, 1 RNA total da pilha HeLa da página foi usado como o molde, (descolamento) ₂₃ oligo como a primeira demão, e a reação foi conduzida em 50°C para o produto do cDNA 30 min.1/10 foi tomada para a amplificação do PCR do gene de GAPDH. A eletroforese do gel do Agarose com mancha do EB mostrou uma única faixa de 550 bp.

Detecção funcional 3: as pilhas HeLa de 500 ng totalizam o RNA como o molde, (descolamento) ₂₃ oligo VN como a primeira demão, reação 50°C para o produto do cDNA 45 min.1/10 foram tomadas para a amplificação do PCR do gene de Polε. A eletroforese do gel do Agarose, EB que mancha, uma única faixa (gc-rica) de 7,1 kb pode ser considerada.

Matérias que precisam a atenção

Impeça a contaminação do RNase

Mantenha por favor a área experimental limpa. As luvas e as máscaras limpas devem ser vestidas durante a operação. RNase-livre será assegurado para os tubos centrífugos, introduzindo com pipeta as pontas e os outros materiais de consumo usados na experiência.

Seleção das primeiras demão

Continue a experiência é PCR

Se o molde é da origem eucariótica, o descolamento oligo está preferido geralmente, emparelhado com o 3' poli uma cauda do mRNA eucariótica para o rendimento máximo do cDNA completo.

As primeiras demão específicas do gene (GSP) têm a especificidade a mais alta. Contudo, em alguns casos, o GSP usou-se para a reação do PCR não pode eficazmente guiar a síntese da primeira costa de cDNA. neste momento, a transcrição reversa pode ser refeita usando o descolamento oligo ou hexamers aleatórios.

Os hexamers aleatórios têm a mais baixa especificidade, e todo o RNA, incluindo o mRNA, rRNA, e tRNA, poderia ser usado como moldes para hexamers aleatórios. Os hexamers aleatórios podem ser usados como uma primeira demão quando a região do alvo tem uma estrutura secundária complexa ou um índice alto do GC, ou quando o molde é prokaryotic e o uso do descolamento oligo ou das primeiras demão gene-específicas (GSP) não pode eficazmente guiar a síntese do cDNA.

Continue a experiência é qPCR

O descolamento oligo misturou com os hexamers aleatórios conduziu à mesma eficiência da síntese do cDNA em cada região do mRNA, ajudando a melhorar a autenticidade e a repetibilidade dos resultados quantitativos.

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