Primeiros reagentes do PCR de Transcriptase do reverso do jogo R1011/R1012 da síntese da costa CDNA

RT - jogo do PCR

Para o uso da pesquisa somente

Cat No. R1011, 20 rxns

Cat No. R1012, 100 rxns

Componentes do jogo

Armazenamento

Todos os componentes do jogo devem ser armazenados em -20°C. mantêm o RNA do controle em -70°C para um armazenamento mais longo.

Descrição

O jogo de RT-PCR é aperfeiçoado para sintetizar o cDNA da primeiro-costa de poli refinado (A)+ ou RNA total. O jogo de RT-PCR para RT-PCR entrega rendimentos aumentados do cDNA, a sensibilidade alta, e transcritos completos em um formato conveniente. Você obtém todos os componentes que você precisa para a síntese bem sucedida do cDNA da primeiro-costa, ganhando seu tempo e assegurando seu sucesso com cada experiência. O jogo Transcriptase reverso é uma versão de M-MLV RT que foi projetado para reduzir a atividade do RNase H e para fornecer a estabilidade térmica aumentada. A enzima é usada para sintetizar o cDNA em uma variação da temperatura de 42-55°C, fornecendo a especificidade aumentada, uns rendimentos mais altos do cDNA, e um produto mais completo do que outros transcriptases reversos.

Aplicações

Primeira síntese do cDNA da costa para RT-PCR

Construção de bibliotecas do cDNA

RT-PCR de uma etapa

Extensão da primeira demão

Notas importantes

Evitando a contaminação do ribonuclease

A pureza e a integridade do RNA são essenciais para a síntese do cDNA completo. O RNA pode ser degradado pelo RNase A, que é um contaminador altamente estável encontrado em todo o ambiente do laboratório. Todos os componentes do jogo foram testados rigorosamente para se assegurar de que fossem RNase-livres. Para impedir a contaminação o ambiente e os reagentes do laboratório, todas as soluções preparadas devem estar livres de RNases. Recomendações gerais evitar a contaminação do RNase:

• DEPC-deleite todos os tubos e pontas da pipeta a ser usadas na síntese do cDNA ou para usar o labware nuclease-livre certificado.
• Vista luvas ao segurar RNA e todos os reagentes, porque a pele é uma fonte comum de RNases. Luvas da mudança frequentemente.
• Use os reagentes RNase-livres, incluindo a água de alta qualidade (por exemplo, água DEPC-tratada).
• Use um inibidor do RNase, tal como Dongsheng RNasin (#R2011) para proteger o RNA da atividade de RNases.
• Mantenha todos os componentes do jogo selou firmemente quando não no uso. Mantenha todos os tubos fechou-se firmemente durante a reação reversa da transcrição.

RNA do molde

O RNA celular total isolado por métodos padrão é apropriado para o uso com o jogo. O RNA refinado deve estar livre dos sais, dos íons do metal, do álcool etílico e do fenol para evitar inibir a reação da síntese do cDNA. Os contaminadores do traço podem ser removidos pela precipitação do álcool etílico do RNA seguido por duas lavagens da pelota com o álcool etílico frio de 75%. Para aplicações de RT-PCR, o RNA do molde deve estar livre da contaminação do ADN. Antes da síntese do cDNA, o RNA pode ser tratado com o DNase I para remover as quantidades de traço de ADN. DNase eu devo ser obtido pelo usuário. Execute sempre uma reação do controle (RT-menos) que inclua todos os componentes para RT-PCR à exceção da enzima reversa do transcriptase.

Digestão do RNase H

A sensibilidade da etapa do PCR pode ser aumentada (especialmente para moldes longos) removendo o molde do RNA do cDNA: Molécula híbrida do RNA pela digestão com RNase H após a síntese da primeiro-costa. A presença do RNase H durante a síntese da primeiro-costa degradará o molde mRNA, tendo por resultado a síntese completo diminuída do cDNA e rendimentos diminuídos do cDNA da primeiro-costa.

Primeiras demão

A síntese do primeiro cDNA da costa pode ser aprontada com (descolamento) primeira demão 15 oligo, primeiras demão aleatórias ou primeiras demão gene-específicas.

(Descolamento) 15 oligo aprontam a síntese do cDNA do poli (A) presente da cauda no 3' - extremidade do mRNA eucariótica. As primeiras demão aleatórias iniciam a síntese do cDNA da população total do RNA (rRNA e mRNA). Consequentemente, usando primeiras demão aleatórias para primeiros resultados da síntese da costa em uma complexidade maior do cDNA gerado comparado com (descolamento) a primeira demão 15 oligo. Consequentemente, a sensibilidade e a especificidade de reações subsequentes do PCR podem ser reduzidas. Contudo, há diversas aplicações onde é benéfico usar primeiras demão aleatórias, tais como a síntese do cDNA usando mRNAs sem um poli (A) cauda, ou utilização da síntese do cDNA poli (A) - amostras enriquecidas do RNA.

as primeiras demão Gene-específicas são usadas para sintetizar o cDNA específico de uma associação do RNA ou do mRNA total e devem ser obtidas pelo usuário.

Primeiramente - procedimento de síntese do cDNA da costa

O primeiro - a reação do cDNA da costa pode ser executada como uma reação individual ou como uma série de reações paralelas com os moldes diferentes do RNA. Consequentemente, a mistura de reação pode ser preparada combinando reagentes individualmente ou uma mistura mestra que contém todos os componentes exceto o RNA do molde pode ser preparada. Segundo a estrutura do molde do RNA, as etapas separadas para a desnaturação do RNA e o recozimento da primeira demão podem melhorar resultados de RT-PCR.

Protocolo

I. Primeira síntese do cDNA da costa

1. Adicione os seguintes reagentes em um tubo estéril, nuclease-livre no gelo na ordem indicada:

2. Misture delicadamente, centrifugue momentaneamente e incube em 70°C para o frio 5 mínimo no gelo, para girar para baixo e colocar para trás o tubo de ensaio no gelo.

3. Prepare a seguinte mistura da síntese do cDNA, adicione os seguintes componentes na ordem indicada:

4. Misture delicadamente e centrifugue momentaneamente.

5. Para (descolamento) ₁₅ oligo, incube para o minuto 60 em 42°C. Para o hexamer aleatório a síntese aprontada, incuba para o minuto 60 em 37°C.

6. Termine a reação aquecendo em 70°C para 5 mínimos.

O produto reverso da reação da transcrição pode ser usado imediatamente em segundas reações da síntese do cDNA da costa ou ser armazenado em -20°C para menos do que uma semana. Para um armazenamento mais longo, -70°C é recomendado.

II. amplificação do PCR do primeiro cDNA da costa

O produto da primeira síntese do cDNA da costa pode ser usado diretamente no PCR ou no qPCR. O volume de primeira mistura de reação da síntese do cDNA da costa não deve compreender mais de 1/10 do volume total da reação do PCR. Normalmente, o μl 2 da primeira mistura de reação da síntese do cDNA da costa é usado como o molde para o PCR subsequente no volume total de 50 μl.