Descrição de produto

Jogo rápido V2 da preparação da biblioteca do ADN

[Nome do produto]

Jogo rápido V2 da preparação da biblioteca do ADN

[Gato. Não/especs.]

Rxns K001S-A/24; Rxns K001S-B/96; rxns do saco 6 da amostra

[Descrição do produto]

Visando a alto-taxa de transferência de Illumina que arranja em sequência a plataforma, este jogo fornece um esquema de construção conveniente e universal da biblioteca do ADN em um tubo. Combina o reparo e a Um-pedra saliente da extremidade em uma etapa, encurtando extremamente a época da construção da biblioteca e reduzindo o erro causado por etapas fastidiosas. A preparação da extremidade, a ligadura do adaptador, a amplificação e a purificação do ADN dobro-encalhado fragmentado podem ser executadas dentro de cerca de 2 horas. A quantificação completa da biblioteca pode ser executada pelo método da tintura fluorescente do dsDNA (por exemplo, Qubit Thermo Flex Fluorometer) ou pelo PCR absoluto da quantificação após ter diluído a biblioteca a uma concentração apropriada.

[Tipo da amostra]

[Condição de armazenamento & vida útil]

Todos os reagentes devem ser armazenados no amortecedor da ligadura de -20°C. são normais para que os cristais precipitem em baixas temperaturas, ele devem ser equilibrados à temperatura ambiente antes de usar. O produto é válido por 12 meses.

[Componentes]

* se há mais de uma amostra, a mistura da primeira demão do adaptador #K002 e #K003 está recomendada. Este jogo fornece um grupo de primeiras demão o índice.

Nota: grânulos recomendados da seleção: Grânulos da seleção Magbeads ou do AMPure XP do ADN de #NC1011 GDSPure.

[Notas]

1. Nós oferecemos dois tipos de primeiras demão universais do adaptador ajustadas (adaptador de GDS, #K002 e #K003, comprados separadamente), mas os clientes podem igualmente escolher de outros fabricantes ou sintetizar seu próprio adaptador para o Illumina que arranja em sequência a plataforma. Demasiado adaptador conduzirá à formação de dímero do adaptador, e o insuficiente adaptador conduzirá à baixa saída da biblioteca. Consequentemente, a concentração apropriada do adaptador determina a concentração e a qualidade da biblioteca. As concentrações recomendadas do adaptador para quantidades diferentes de entrada do ADN são mostradas na seguinte tabela:

Concentrações recomendadas do uso da tabela 1 de adaptador

* adaptador: A relação de toupeira da inserção refere a relação do número do molar do adaptador de outras fontes ao número entrado do molar do ADN, que pode aproximadamente ser calculado com referência à seguinte fórmula:

Entrado ADN número (pmol) ≈Input ADN massa) (do ng/[comprimento da média do ADN 0.66×Input (bp)]

qualidade do *The e concentração do adaptador extremamente para afetar a saída da biblioteca, especialmente para baixas bibliotecas da entrada. O adaptador de uma fonte de alta qualidade deve ser selecionado e diluído a uma concentração apropriada com o 0.1×TE antes da ligadura. Para o uso imediato, assegure-se de que cada adição da amostra seja uns 5 fixos μl, evite-se erros da adição da amostra, e tente-se evitar a gelo-aproximação amigável repetida.

2. A enzima usada na mistura mestra do PCR da biblioteca 2× DE ALTA FIDELIDADE é uma polimerase de ADN da família de B, que tenha 5" - 3" polimerase e 3" - 5" atividades do exonuclease, mas falta 5" - 3" atividades do exonuclease. Tem a alta fidelidade e a homogeneidade, e a capacidade sustentável forte da síntese. O controle restrito do número de ciclos da amplificação é particularmente importante para a saída da biblioteca. A seguinte tabela mostra o número recomendado de ciclos da amplificação que correspondem às quantidades diferentes de entrada do ADN:

Número recomendado da tabela 2 de ciclos da amplificação que correspondem às entradas diferentes da amostra

Nota: 1. A tabela acima mostra os resultados da análise usando 150bp o ADN padrão, que é para a referência somente.

2. Se os conectores incompletos são usados, um número mínimo dos ciclos (1-3) deve ser amplificado para obter uma biblioteca completa.

3. Se a qualidade do ADN da entrada é pobre, ou a seleção de tamanho está realizada durante a construção da biblioteca, o número de ciclos da amplificação deve apropriadamente ser aumentado.

[Processo padrão da construção da biblioteca]

Reparo do fim

Nota: Se o ADN fragmentado excede o μl 45 antes que esta etapa, ou o amortecedor estejam incompatíveis com o amortecedor do reparo do fim, uma purificação magnética do grânulo deve ser executada primeiramente.

1. Prepare a seguinte reação em um tubo do PCR de 200 μl:

2. Redemoinho delicadamente e rotação para baixo momentaneamente a misturar bem, centrifugar momentaneamente e recolher todo o líquido à parte inferior do tubo.

3. Execute a seguinte reação em um cycler térmico:

Ligadura do adaptador

1. Continue com a reação da ligadura o mais cedo possível após a preparação da extremidade.

2. Dilua o adaptador de acordo com a tabela 1.

3. Prepare o seguinte sistema de reação:

4. Redemoinho delicadamente e rotação para baixo momentaneamente a misturar bem, centrifugar momentaneamente e recolher todo o líquido à parte inferior do tubo.

5. Execute a seguinte reação em um cycler térmico:

Solução recomendada para a limpeza do PCR/seleção de tamanho (o volume magnético específico do grânulo deve ser ajustado de acordo com o tamanho da amostra real)

1. Prepare 100 produtos da ligadura do μl em um tubo de centrifugador apropriado.

2. Adicione o μl 100 de grânulos magnéticos resuspended da seleção do ADN à amostra. Delicadamente sopro com uma pipeta por 10 vezes (ou redemoinho para 30 s). Incube amostras para o minuto 5 na temperatura ambiente.

3. Coloque o tubo em uma cremalheira magnética apropriada para separar os grânulos do supernatant. Quando a solução for clara, para remover e rejeitar com cuidado o supernatant com uma pipeta (não rejeite grânulos).

4. Adicione o μl 200 do álcool etílico recentemente preparado de 80% ao tubo quando na cremalheira magnética. Incube na temperatura ambiente para 30 s, e para remover então e rejeitar com cuidado o supernatant (não perturbe grânulos).

5. Repita etapa 4 uma vez para um total de duas lavagens.

Nota: Seja certo remover todo o líquido visível após o segundo Washington.

6. O ar seca os grânulos até que a superfície dos grânulos magnéticos não tenha nenhum brilho óbvio quando o tubo estiver na cremalheira magnética com a tampa aberta.

Nota: Faça não overdry os grânulos, este pode conduzir a uma mais baixa recuperação do ADN. Quando os grânulos começam se rachar, estão demasiado secos.

7. Remova o tubo da cremalheira magnética. Adicione o amortecedor da eluição de 22 μl (Tris-HCl, pH8.0-8.5 de 10mM) ao tubo. Misture bem introduzindo com pipeta para cima e para baixo pelo menos 10 vezes ou em um misturador do redemoinho para 30 o S. incuba para o minuto 3-5 na temperatura ambiente.

8. Coloque o tubo na cremalheira magnética. Após o minuto 5 (ou quando a solução for clara), supernatant do μl de transferência 20 a um tubo novo. A seleção é terminada, e o ADN selecionado pode ser usado para experiências subsequentes ou ser armazenado em -20°C por muito tempo.

Amplificação da biblioteca

1. Prepare a seguinte reação em um tubo do PCR de 200 μl:

2. Redemoinho delicadamente e rotação para baixo momentaneamente a misturar bem, centrifugar momentaneamente e recolher todo o líquido à parte inferior do tubo.

3. Execute a seguinte reação em um cycler térmico:

Solução recomendada para a limpeza do PCR/seleção de tamanho (o volume magnético específico do grânulo deve ser ajustado de acordo com o tamanho da amostra real)

1. Prepare 50 produtos da ligadura do μl em um tubo de centrifugador apropriado.

2. Adicione o μl 45 de grânulos magnéticos resuspended da seleção do ADN à amostra. Delicadamente sopro com uma pipeta por 10 vezes (ou redemoinho para 30 s). Incube amostras para o minuto 5 na temperatura ambiente.

3. Coloque o tubo em uma cremalheira magnética apropriada para separar os grânulos do supernatant. Quando a solução for clara, para remover e rejeitar com cuidado o supernatant com uma pipeta (não rejeite grânulos).

4. Adicione o μl 200 do álcool etílico recentemente preparado de 80% ao tubo quando na cremalheira magnética. Incube na temperatura ambiente para 30 s, e para remover então e rejeitar com cuidado o supernatant (não perturbe grânulos).

5. Repita etapa 4 uma vez para um total de duas lavagens.

Nota: Seja certo remover todo o líquido visível após o segundo Washington.

6. O ar seca os grânulos até que a superfície dos grânulos magnéticos não tenha nenhum brilho óbvio quando o tubo estiver na cremalheira magnética com a tampa aberta.

Nota: Faça não overdry os grânulos, este pode conduzir a uma mais baixa recuperação do ADN. Quando os grânulos começam se rachar, estão demasiado secos.

7. Remova o tubo da cremalheira magnética. Adicione o amortecedor da eluição de 22 μl (Tris-HCl, pH8.0-8.5 de 10mM) ao tubo. Misture bem introduzindo com pipeta para cima e para baixo pelo menos 10 vezes ou em um misturador do redemoinho para 30 o S. incuba para o minuto 3-5 na temperatura ambiente.

8. Coloque o tubo na cremalheira magnética. Após o minuto 5 (ou quando a solução for clara), supernatant do μl de transferência 20 a um tubo novo. A seleção é terminada, e o ADN selecionado pode ser armazenado em 2-8°C por 1-2 semanas ou ser armazenado em -20°C por muito tempo.

[Apêndice] esquema recomendado para seleção frente e verso

Se a seleção dobro-redonda é exigida, nós fornecemos o seguinte esquema para selecionar o volume magnético apropriado do grânulo de acordo com o tamanho previsto da biblioteca. A seleção de tamanho pode ser executada antes do reparo do fim ou após a amplificação. Uma seleção dois ou dobro-mais redondos reduzirá extremamente o rendimento da biblioteca.

Encha o volume da biblioteca na tabela abaixo ao μl 100. Selecione o volume de grânulos magnéticos em dois círculos de acordo com o tamanho previsto da biblioteca. E realize a operação da seleção de acordo com as seguintes instruções.

Uma quantidade recomendada da tabela 3 de grânulos magnéticos para a seleção Dobro-redonda

1. Encha o volume da biblioteca ao μl 100 em um tubo do PCR 200μl e etiquetado como A. Adição algum volume de grânulos magnéticos de acordo com a tabela 3 (círculo 1) ao sopro de A. Delicado do tubo com uma pipeta para 30 S. incuba amostras para o minuto 5 na temperatura ambiente.

2. Coloque o tubo A em uma cremalheira magnética apropriada para separar os grânulos do supernatant. Quando a solução é clara, remova com cuidado o supernatant a um tubo novo e etiquete-o como grânulos de B. Rejeição.

3. Adicione algum volume de grânulos magnéticos de acordo com a tabela 3 (círculo 2) ao sopro de B. Delicado do tubo com uma pipeta para 30 que o S. incuba amostras para o minuto 5 na temperatura ambiente. Coloque o tubo B na cremalheira magnética. Quando a solução for clara, para remover e rejeitar com cuidado o supernatant.

4. Adicione o μl 200 do álcool etílico recentemente preparado de 80% ao tubo B quando na cremalheira magnética. Incube na temperatura ambiente para 30 s, e para remover então e rejeitar com cuidado o supernatant (não perturbe grânulos).

5. Repita etapa 6 uma vez para um total de duas lavagens.

Nota: Seja certo remover todo o líquido visível após o segundo Washington.

6. O ar seca os grânulos até que a superfície dos grânulos magnéticos não tenha nenhum brilho óbvio quando o tubo B estiver na cremalheira magnética com a tampa aberta.

Nota: Faça não overdry os grânulos, este pode conduzir a uma mais baixa recuperação do ADN. Quando os grânulos começam se rachar, estão demasiado secos.

7. Remova o tubo B da cremalheira magnética. Adicione o amortecedor da eluição de 22 μl ao tubo. Misture bem introduzindo com pipeta para cima e para baixo pelo menos 10 vezes ou em um misturador do redemoinho para 30 o S. incuba para o minuto 3-5 na temperatura ambiente.

Nota: Se a captação visada não será executada, adicione o amortecedor da eluição (Tris-HCl de 10mM, pH 8.0-8.5) para a eluição. Se não, a água ultrapure esterilizada deve ser usada para a eluição.

• Tubo B do lugar na cremalheira magnética. Supernatant do μl de transferência 20 a um tubo novo.

Para o uso da pesquisa somente